2023年2月15日，国际期刊《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）在线刊发了化学与化工学院、生物无机化学与药物湖北省重点实验室钟芳锐教授团队完成的最新研究成果“拓展铜酶杂泛性催化吲哚氧化交叉偶联反应”（Expanding Promiscuity of a Copper-Dependent Oxidase for the Enantioselective Cross-Coupling of Indoles, DOI: 10.1002/anie.202219034）。该论文报道了首例铜外排氧化酶(CueO)催化吲哚类底物的氧化交叉偶联反应，合成了一系列光学纯2,2-二取代吲哚啉-3-酮类化合物。该反应具有条件温和、催化剂经济、选择性高、底物普适性好等优点，所制备的光学纯吲哚3-酮衍生物ee值高达99%，并基于这些产物的生物活性筛选得到了两个具有显著抗肿瘤活性分子。
多铜氧化酶（MCOs）广泛存在与自然界中，一般具有较低的底物特异性，可接纳多种天然底物，其中主要类别是酚类化合物。MCOs通过单电子转移机制催化酚的氧化反应，生成易二聚或寡聚的活性苯氧自由基，往往难以控制氧化反应中间体的下游转化。这种性质导致单一漆酶催化酚类氧化偶联反应的选择性不高，易形成多种区域异构体和立体异构体的混合物，立体化学的调控往往需要借助额外的辅助蛋白，这限制了多铜氧化酶的适用范围。
钟芳锐团队致力于绿色仿生和生物催化领域的研究，利用化学原理驱动酶催化选择性合成的理念，发展了含有非天然光敏活性基团的人工光敏金属酶（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 617）和“三重态光酶”（Nature, 2022, 611, 715）。基于铜催化氧化偶联反应的化学机制，发展了多铜氧化酶催化的多酚氧化环加成反应（Green Chem, 2022, 24, 5598.）。
针对上述问题，钟芳锐团队提出了“金属催化原理驱动酶促非天然氧化交叉偶联”的研究思路，基于铜离子的氧化还原性质，将二价铜离子的“单电子催化氧化”机制与酶的“微环境效应”相耦合，通过在酚类底物中引入额外的氢键供体/受体与酶的手性空腔形成有益的相互作用，成功实现了氧化偶联反应的对映选择性调控（图1）。
图1.多铜氧化酶不对称催化氧化交叉偶联反应的设计思路
该研究建立的酶催化不对称交叉偶联具有较好的底物兼容性（图2）。苯环上含有不同电子和立体性质取代基的吲哚酚能顺利发生预期反应，收率为73-78％，立体选择性一般都为99％ee。此外，不同位置取代的吲哚亲核试剂、富电子类吡咯、1,3,5-三甲氧基苯和1,3-二甲氧基苯也同样适用。亲核试剂的范围还可以进一步扩展到sp3杂化的碳亲核试剂，如环状和非环状β-酮酸酯，相应的产物均具有极好的立体选择性。部分底物的放大实验（0.3-1.0mmol）发现，产物的产率和光学纯度不受影响。
图2.代表性底物的结果
研究团队对该酶促反应的机理进行了深入的研究（图3）。首先通过控制实验捕获和验证了中间体分子的生成。在此基础上，通过铜的配位环境分析、中间体分子与酶的分子对接模拟等实验，提出了底物与酶的可能作用模型：中间体的酯基与CueO酶Asn240的酰胺N-H和Lys188的氨基存在着弱氢键作用；这些相互作用可能对交叉偶联反应的反应性和对映选择性至关重要。当将这两个氨基酸残基突变成丙氨酸，所得突变体CueO_K188A和CueO_N240A的催化效果显著降低。这一结果验证了上述推测的酶作用方式的合理性。
图3.CueO酶催化的机理研究
相关文献表明，2,2-二取代吲哚啉-3-酮类分子可能具有显著的生物活性。作者利用MTT法测定了部分产物对MCF-7肿瘤细胞系的毒性，得到了两个显著抗肿瘤活性的化合物3f和4a（浓度为50μM）。随后的详细实验拟合得到了两者的IC50值分别为34.31 μM和37.2 μM，均高于临床药物伊立替康和5-氟尿嘧啶（图4），具有潜在的药物应用价值。
图4.部分化合物的细胞毒性测试
我校为论文的唯一完成单位，钟芳锐教授是论文的唯一通讯作者。该论文第一作者为化学与化工学院2019级博士研究生郭欢。化学与化工学院2020级博士研究生孙宁宁为论文的共同第一作者。该项工作得到了国家重点研发计划（2018YFA0903500）、国家自然科学基金（21602067）和湖北科技创新重大专项（2019ACA125）资助。
文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202219034
